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新冠病毒核酸定性检测原理
发布者:叶林雅发布时间:2022-03-30 17:54:03阅读(1295) 评论(1) 举报
高中生物学选择性必修3《生物工程和技术》,都是以技术为基础的知识原理和应用为重点考查,因此需要在平时教学中侧重专业技术的介绍。最近疫情严重,两天一次的核酸检测,也是频率够高了,那么,新冠病毒核酸定性检测原理是什么?
1.新冠病毒核酸定性检测原理
新型冠状病毒核酸检测,对于临床早发现、早诊断、早隔离、早治疗至关重要,是有效防控新冠肺炎疫情的关键技术支撑。
现在的病毒核酸检测试剂盒,多数采用荧光定量PCR方法。检测原理就是以病毒独特的基因序列为检测靶标,通过PCR扩增,使我们选择的这段靶标DNA序列指数级增加(扩增),每一个扩增出来的DNA序列,都可与我们预先加入的一段荧光标记探针结合,产生荧光信号,扩增出来的靶基因越多,累积的荧光信号就越强。
而没有病毒的样本中,由于没有靶基因扩增,因此就检测不到荧光信号增强。所以,核酸检测,其实就是通过检测荧光信号的累积来确定样本中是否有病毒核酸。
影响核酸检测准确度的因素:
核酸检测结果的准确与否,不仅与试剂盒自身的检测准确性有关,也跟检测样本采集的时机和检测样本的类型密切相关。
首先,采样时机很重要,如果病人刚吃过饭、刷过牙,咽部的病毒被清洗掉了,这时候去采集,即使是病毒感染阳性病人,核酸检测也容易出现阴性结果。所以,通常在采集呼吸道样本前别喝水、别吃饭。
检测结果还跟待测样本的类型有关:
同一病人同一时间采集的不同样本,检测结果差别也会很大。在目前检测的新型冠状病毒感染病人样本中,通常肺部灌洗液和痰液中的病毒核酸量高于鼻、咽等呼吸道拭子,而呼吸道拭子中的病毒核酸量会远远高于血液。
另外,随着病程的不断变化,病人体内的病毒量也在动态变化。所以确实会有不同时间采样检测结果不同的情况。
2.腺病毒疫苗的制备技术
现在的新冠疫苗有两类:灭活疫苗和腺病毒载体疫苗,主要是两种技术路线的区别。
灭活疫苗是将培养扩增的活病毒通过理化方法,灭活以后经过系列纯化技术制备的疫苗,其主要特点是疫苗成份和天然的病毒结构比较相似。通常免疫应答也比较强,具有良好的安全性。
腺病毒载体疫苗,顾名思义,是一种将腺病毒作为载体制备而成的疫苗。腺病毒是一种在自然界中广泛分布的病毒,人体腺病毒大约有52种,其中的5型腺病毒(Ad5)和2型腺病毒(Ad2)一般被用作载体使用。
我国采取5型腺病毒作为载体,导入新冠病毒抗原基因,通过生物反应器制成活载体疫苗,制备工艺相对简单,成本较低。因为它是在我国原有的5型腺病毒埃博拉疫苗平台基础上研发成功的,不仅能够诱导很好的中和抗体产生,还能增强细胞免疫。
这些作为载体的腺病毒会被提前敲掉复制所需的基因,使其可以感染人体细胞,却不能进行自我复制,保证了使用的安全性。
以新冠病毒腺病毒载体疫苗为例,具体来说,就是先将新冠病毒表达特异性抗原(S蛋白)的基因重组到有复制缺陷的腺病毒(5型腺病毒)的基因组中,然后将腺病毒制成疫苗后注入人体,使其感染人体细胞,并在细胞内表达出所需的特异性抗原(S蛋白),由于其在过程中感染了细胞,因此会引发体液免疫和细胞免疫,使接种者产生对新冠病毒较强的免疫力。
3.单克隆抗体的制备原理
单克隆抗体制备原理:
B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力、B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的、将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。
单克隆抗体制备的过程:
(1)免疫动物
免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞。
(2)细胞融合
采用二氧化碳气体处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨,制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合,并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。
(3)选择性培养
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性培养基。
在HAT培养基中,未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖。
(4)杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化。
通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存。
(5)单克隆抗体的大量制备
单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。
体内诱生法:
取BALB/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后,腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖,并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周,可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可获得大量单克隆抗体。
体外培养法:
将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中,杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体,收集培养上清液,离心去除细胞及其碎片,即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现,大大提高了抗体的生产量。
例、我国在新冠疫情防控方面取得了显著的成绩,但全球疫情形势仍然非常严峻,尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎,更是威胁着全人类的生命健康。
(1)新冠病毒核酸定性检测原理是:以新冠病毒的单链RNA为模板,利用 ▲ 酶合成DNA,经PCR扩增,然后在扩增产物中加入特异的 ▲ ,如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
(2)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是:将腺病毒的复制基因敲除;以新冠病毒的 ▲ 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原,从而引发特异性免疫反应。在此过程中,腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 ▲ 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 ▲ 。
(3)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是:取免疫阳性小鼠的 ▲ 细胞与骨髓瘤细胞混合培养,使其融合,最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比,杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分,如胰岛素和 ▲ 。
答案:
(1)逆转录 核酸探针
(2)抗原 载体 使腺病毒失去复制能力
(3)脾 动物血清
解析:该试题考查新冠病毒核酸检测、腺病毒疫苗制备技术、单克隆抗体的制备原理等知识。
(1)新冠病毒核酸定性检测原理是以新冠病毒的单链RNA为模板,利用逆转录酶合成DNA,经PCR扩增,然后在扩增产物中加入特异的核酸探针,如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性
(2)腺病毒疫苗的制备技术要点是将腺病毒的复制基因敲除,以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原,从而引发特异性免疫反应。在此过程中,腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。
(3)单克隆抗体的制备原理是取免疫阳性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞混合培养,使其融合,最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比,杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分,如胰岛素和动物血清。